|
|
Strukturní a funkční charakterizace inhibice koronavirové methyltransferázy.
Ivanovská, Dana ; Bouřa, Evžen (vedoucí práce) ; Faltová, Lenka (oponent)
Koronavirové methyltransferasy se účastní modifikace 5'-konce virové RNA. Svou enzymatickou aktivitou zajištují nejen účinnou translaci virových proteinů, ale také maskují vlastní RNA před imunitním systémem hostitele. Tato práce se zaměřuje na methyltransferasy SARS-CoV-2 (methyltransferasová doména nestrukturního proteinu 14, MT14 a nestrukturní protein 16 spolu s jeho kofaktorem - nestrukturní protein 10, nsp16/10), které představují atraktivní cíle pro terapeutický zásah. Cílem této práce byla strukturní charakterizace koronavirových methyltransferas v komplexu s různými malými molekulami. Rekombinantně připravené proteiny byly purifikovány a následně podrobeny krystalizačním experimentům. Získané krystaly heterodimeru nsp16/10 v komplexu se sinefunginem byly namáčeny do roztoku obsahujícího nukleotidový analog S-adenosyl-L-homocysteinu. Optimalizací identifikovaných primárních krystalizačních podmínek MT14 s dvěma různými inhibitory byly získány krystaly vhodné pro měření jejich difrakce a následnou strukturní analýzu. Získaná strukturní data budou sloužit jako podklad pro návrh nových inhibitorů cílících na S-adenosyl- L-methionin vazebné místo nsp14. Klíčová slova: methyltransferasa, nsp14, nsp16, koronavirus, SARS-CoV-2, rekombinantní exprese, krystalizace proteinů
|
|
|
Creating an in-vitro model system for studying phase separation in virus assembly
WIENER, Katharina
This thesis focuses on the study of the ?NS protein of the avian reovirus and as this virus is causing considerable annual losses in the poultry industry, understanding its replicative cycle on a molecular basis is highly anticipated. One area of interest is hereby the formation of so-called viroplasms via liquid-liquid phase separation (LLPS) of the ?NS protein. The exact processes involved in LLPS, however, remain mostly unknown. By establishing an in-vitro model system we tried to elucidate the environmental conditions needed for phase separation, in order to gain a better understanding of the viral replicative cycle, as well as LLPS in general.
|
|
|
Produkce cysteinových katepsinů a strukturní charakterizace jejich interakce s peptidomimetickými inhibitory
Wichterle, Filip ; Mareš, Michael (vedoucí práce) ; Knejzlík, Zdeněk (oponent)
Cysteinové katepsiny se účastní řady patologických procesů jako jsou nádorová, neurodegene- rativní, kardiovaskulární nebo autoimunitní onemocnění. Tato práce se zaměřuje na katepsin B, L a V (CatB, CatL, CatV), které jsou atraktivními cílovými molekulami pro vývoj inhibitorů jako potenciálních chemoterapeutik a diagnostických nástrojů. Cílem práce bylo připravit uve- dené katepsiny a strukturně charakterizovat jejich komplexy s vybranými syntetickými pepti- domimetickými inhibitory. CatB a CatL byly rekombinantně připraveny v kvasinkách Pichia pastoris a podmínky exprese byly optimalizovány pro přípravu proenzymových forem. Pro CatB a CatL byl navržen chromatografický purifikační protokol a CatV byl purifikován na zá- kladě již známého protokolu. Získané enzymy byly použity k přípravě komplexů se šesti pep- tidomimetickými inhibitory vybavenými karbamátovou, vinylsulfonovou nebo azanitrilovou reaktivní skupinou, které selektivně inhibují CatB, CatL, resp. CatV. Byly určeny jejich inhi- biční parametry v kinetickém testu a identifikovány počáteční krystalizační podmínky. Po op- timalizaci krystalizačních podmínek pro CatB se třemi karbamátovými inhibitory byly získány krystaly vhodné pro rentgenostrukturní analýzu. Na základě krystalových struktur těchto kom- plexů byl analyzován vazebný mód...
|
|
|
Nové inhibitory HIV proteasy: návrh, synthesa a testování aktivity
Schimer, Jiří ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent)
HIV proteasa zůstává jedním z hlavních terapeutických cílů při léčbě HIV. V současné době je na trhu 9 schválených inhibitorů HIV proteasy. Nicméně, díky vysoké chybovosti reversní transkriptasy byla vůči každému z nich již popsána rezistence. Právě proto hledání nového inhibitoru s rozdílným vazebným modem je stále aktuálním tématem. Nový typ proteasových inhibitorů (1, 4-benzodiazepinové analogy) byl nedávno objeven v naší laboratoři. Tato nová skupina látek je velice aktivní (Ki v řádech 10-9 ), ale zároveň má několik nežádoucích vlastností, mezi které patří například špatná rozpustnost, či velké množství stereogenních center. Hlavním úkolem této práce bylo pokusit se připravit rozpustnější sloučeninu s menším počtem možných stereoisomerů, enzymologicky charakterizovat její vazbu na přirozenou a mutantní proteasu z viru HIV a určit její strukturu v komplexu s tímto enzymem. Malá knihovna 1, 4-benzodiazepinových inhibitorů byla připravena a plně charakterizována pomocí NMR spektroskopie a hmotnostní spektrometrie. Počet stereogenních center byl úspěšně zredukován ze 4 na 2 bez jakékoliv ztráty aktivity. Zvýšení rozpustnosti vedlo vždy zároveň i ke snížení aktivity. Všechny strukturní a kinetické studie byly prováděny s nejaktivnějším inhibitorem, který byl ale omezeně rozpustný. Byl určen...
|
|
|
Studium receptor-ligandového páru NKR-P1F a Clrg
Kotýnková, Kristýna ; Man, Petr (vedoucí práce) ; Schneider, Bohdan (oponent)
Studim receptor - ligandového páru NKR-P1F a Clrg Myší receptor - ligandový pár NKR-P1F a Clrg je důležitou součástí receptorového "zipu", který vzniká při kontaktu mezi NK buňkou a cílovou buňkou. Tento pár představuje jeden z příkladů nedávno objevených interakcí typu lektin-lektin, které jsou důležité při rozpoznání u mnoha imunocytů. Za účelem studia struktury těchto proteinů a jejich vzájemné interakce byly připraveny vektory pET-30a(+) pro bakteriální expresi. Tyto vektory kódovaly části extracelulárních domén obou proteinů. Po indukci IPTG byly proteiny produkovány ve formě inkluzních tělísek, ze kterých byly renaturovány in vitro. Renaturované proteiny byly purifikovány kombinací ionexové a gelové chromatografie. Konstrukt pro protein NKR-P1F poskytoval při použití standardních renaturačních protokolů pouze malé výtěžky solubilního proteinu, a navíc vyvstaly problémy s reprodukovatelností výsledků renaturace. V případě Clrg nebyly standardní postupy skládání úspěšné. Kvůli tomu bylo přistoupeno k mutaci lichého cysteinu, který nezapadal do obvyklého vzoru pro tyto receptory. Cystein byl mutován na serin a produkt výsledného C148S konstruktu již bylo možnorenaturovat in vitro. Dále bylo zjištěno, že přídavek (benzyldimethylamonnia)propansulfonátu do renaturačního pufru zvyšuje výtěžek solubilního...
|
|
|
Příprava a biochemická charakterizace proteasového inhibitoru equistatinu
Polatová, Daniela ; Mareš, Michael (vedoucí práce) ; Bořek Dohalská, Lucie (oponent)
Equistatin ze sasanky koňské (Actinia equina) obsahuje proteinovou doménu Eqd2, která inhibuje aspartátové peptidasy, ale dosud nebyla detailně charakterizována. Rekombinantní Eqd2 byl připraven v kvasinkovém expresním systému a byl navržen protokol pro jeho chromatografickou purifikaci. Pomocí fluorescenčního inhibičního testu byla určena inhibiční specifita Eqd2, která ukázala, že je vysoce selektivním inhibitorem peptidas typu katepsinu D a pepsinu z rodiny aspartátových peptidas A1. Dále byla pomocí gelové chromatografie analyzována tvorba komplexu Eqd2-peptidasa a oligomerizace Eqd2 v roztoku. Za účelem budoucí rentgenostrukturní analýzy Eqd2 byla provedena primární analýza krystalizačních podmínek. Tato práce přináší nové významné informace o Eqd2 jako unikátním typu přirozených inhibitorů aspartátových peptidas. Lze předpokládat, že určení interakčního mechanismu Eqd2 umožní navrhovat jeho syntetická mimetika pro regulaci medicinálně významných peptidas. Klíčová slova: peptidasové inhibitory, proteolytické enzymy, aktivita a inhibice enzymů, rekombinantní exprese, purifikace proteinů, krystalizace proteinů, equistatin
|
|
|
Příprava lidského NK buněčného receptoru KACL
Nový, Jiří ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Moserová, Michaela (oponent)
NK buňky neboli přirození buněční zabíječi jsou důležitou součástí imunitního systému organismů. Jejich specifickou vlastností je to, že dokážou rozeznat a zneškodnit některé nádorové buňky a buňky infikované virem bez jakéhokoliv předchozího signálu. Jejich funkce je závislá na aktivitě povrchových stimulačních a inhibičních receptorů, které se aktivují interakcí s ligandy na povrchu cílových buněk. Interakce lidského NK receptoru NKp65 a ligandu KACL je velmi specifická, což potvrzuje velmi vysoká afinita interakce, která je oproti jiným příbuzným komplexům až 400× vyšší. O tomto komplexu je zatím známo jen málo informací, ale je jisté, že se účastní imunitních procesů v kůži, neboť KACL je produkován výhradně keranocyty. Náplní této bakalářské práce byla příprava rozpustné formy receptoru KACL za pomoci rekombinantní exprese proteinů v lidských embryonálních ledvinných buňkách s homogenní glykosylací (linie HEK293S GnTI- ). Protein byl následně charakterizován gelovou chromatografií a SDS elektroforézou. Správné zapojení čtyř cysteinů do dvou disulfidických můstků bylo ověřeno hmotnostní spektrometrií. S připraveným proteinem KACL bylo zahájeno strukturní studium metodou krystalizace proteinů.
|
|
|
Nové inhibitory HIV proteasy: návrh, synthesa a testování aktivity
Schimer, Jiří ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent)
HIV proteasa zůstává jedním z hlavních terapeutických cílů při léčbě HIV. V současné době je na trhu 9 schválených inhibitorů HIV proteasy. Nicméně, díky vysoké chybovosti reversní transkriptasy byla vůči každému z nich již popsána rezistence. Právě proto hledání nového inhibitoru s rozdílným vazebným modem je stále aktuálním tématem. Nový typ proteasových inhibitorů (1, 4-benzodiazepinové analogy) byl nedávno objeven v naší laboratoři. Tato nová skupina látek je velice aktivní (Ki v řádech 10-9 ), ale zároveň má několik nežádoucích vlastností, mezi které patří například špatná rozpustnost, či velké množství stereogenních center. Hlavním úkolem této práce bylo pokusit se připravit rozpustnější sloučeninu s menším počtem možných stereoisomerů, enzymologicky charakterizovat její vazbu na přirozenou a mutantní proteasu z viru HIV a určit její strukturu v komplexu s tímto enzymem. Malá knihovna 1, 4-benzodiazepinových inhibitorů byla připravena a plně charakterizována pomocí NMR spektroskopie a hmotnostní spektrometrie. Počet stereogenních center byl úspěšně zredukován ze 4 na 2 bez jakékoliv ztráty aktivity. Zvýšení rozpustnosti vedlo vždy zároveň i ke snížení aktivity. Všechny strukturní a kinetické studie byly prováděny s nejaktivnějším inhibitorem, který byl ale omezeně rozpustný. Byl určen...
|
|
|
Studium receptor-ligandového páru NKR-P1F a Clrg
Kotýnková, Kristýna ; Man, Petr (vedoucí práce) ; Schneider, Bohdan (oponent)
Studim receptor - ligandového páru NKR-P1F a Clrg Myší receptor - ligandový pár NKR-P1F a Clrg je důležitou součástí receptorového "zipu", který vzniká při kontaktu mezi NK buňkou a cílovou buňkou. Tento pár představuje jeden z příkladů nedávno objevených interakcí typu lektin-lektin, které jsou důležité při rozpoznání u mnoha imunocytů. Za účelem studia struktury těchto proteinů a jejich vzájemné interakce byly připraveny vektory pET-30a(+) pro bakteriální expresi. Tyto vektory kódovaly části extracelulárních domén obou proteinů. Po indukci IPTG byly proteiny produkovány ve formě inkluzních tělísek, ze kterých byly renaturovány in vitro. Renaturované proteiny byly purifikovány kombinací ionexové a gelové chromatografie. Konstrukt pro protein NKR-P1F poskytoval při použití standardních renaturačních protokolů pouze malé výtěžky solubilního proteinu, a navíc vyvstaly problémy s reprodukovatelností výsledků renaturace. V případě Clrg nebyly standardní postupy skládání úspěšné. Kvůli tomu bylo přistoupeno k mutaci lichého cysteinu, který nezapadal do obvyklého vzoru pro tyto receptory. Cystein byl mutován na serin a produkt výsledného C148S konstruktu již bylo možnorenaturovat in vitro. Dále bylo zjištěno, že přídavek (benzyldimethylamonnia)propansulfonátu do renaturačního pufru zvyšuje výtěžek solubilního...
|
host ::
RSS.